Tutuklanmış L.Kefir ile enantiyomerik saflıkta 1- fenil etanol üretiminin dolgulu kolon biyoreaktörde incelenmesi
No Thumbnail Available
Date
2011
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Abstract
Enantiyomerik saflıktaki kiral alkoller pek çok farmokolojik ürünün çıkış maddesidir. Bu projede ilaç etken maddesi olarak geniş kullanım alanına sahip olan 1-fenil etanolün üretimi, asetofenonun alkol dehidrojenaz (ADH) enzimi katalizli asimetrik indirgenme tepkimesiyle gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, mikroorganizmaların, enzimlere göre daha ekonomik olması nedeniyle ADH aktivitesine sahip, Lactobacillus kefir NRRL B-1839 mikroorganizması kullanılmıştır. Bir prokiral keton olan asetofenonun asimetrik indirgenmesiyle enantiyomerik saflıkta 1-fenil etanolün üretimi tutuklanmış Lactobacillus kefir ile sürekli işletilen dolgulu kolon biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, serbest Lactobacillus kefir hücreleriyle çalışılmış ve bu mikroorganizmanın R-enantiyomer için yüksek enantiyomerik aşırılık verdiği (> % 99) görülmüştür. Özellikle farmokolojik ürün üretiminde yüksek enantiyomerik aşırılık istenen bir durumdur. Ancak ulaşılan dönüşüm değerlerinin; düşük substrat derişimlerinde (Co=1 mM) bile, düşük (% 80) olduğu görülmüştür. Asimetrik indirgeme tepkimelerini oksidoredüktaz sınıfından, alkol dehidrojenaz (ADH) enzimi katalizler ve bu enzim kofaktöre ihtiyaç duyarlar. Düşük substrat derişimlerinde bile dönüşümün düşük olması nedenini enzimin kofaktörünün tepkime sırasında tükenmesidir. Bu yüzden tepkime esnasında kofaktör ilavesi veya kofaktör rejenerasyonunun gerekli olduğunu göstermiştir. Kofaktörler pahalı olduklarından ve tepkime sonucu tükendiklerinden, kofaktör rejenerasyonunun yapılması daha ekonomik olmaktadır. Kofaktör rejenerasyonu, ucuz karbon kaynakları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, kofaktör rejenerasyonu için üç farklı yol izlenmiş ve en iyi sonuçlar glikoz ile yapılan kofaktör rejenerasyonu ile elde edilmiştir. Diğer rejenerasyon türleri olarak, 2-propanolün kullanılması ve gen klonlama ile alkol dehidrojenaz ve laktat dehidrojenaz enzimlerinin Escherichia coli’ ye aktarılarak, iki enzim ile kofaktör rejenerasyonudur. 2-propanol ile 20 mM başlangıç substrat derişiminde gerçekleştirilen deneylerde, hem enantiyomerik aşırılık (% 97) hemde dönüşüm açısından (% 95), glikoz sonuçlarına göre (enantiyomerik aşırılık >% 99 ve dönüşüm % 100) daha düşük değerler elde edilmiştir. Alkol dehidrojenaz (ADH) ve laktat dehidrojenaz (LDH) enzimlerini içeren rekombinant Escherichia coli de, LDH enzimi aktivite gösterirken, ADH aktivite göstermemiştir. Bu nedenle çalışmanın ilerleyen kısımlarında, glikoz ile kofaktör rejenerasyonu sağlanmıştır. R-1-fenil etanol üretimini, sürekli sistemde gerçekleştirmeden önce, tutuklanmış mikroorganizma ile kesikli sistemde çalışılmıştır. En uygun koşullar, sıcaklık, 35 oC, pH 8 Tris tamponu, kofaktör rejenerasyonu için % 2 w/v glikoz, 4 h olarak bulunmuştur. Bu koşullar belirlendikten sonra, 1,7 cm iç çapında, 27 cm dolgu yüksekliğinde pyrex camdan yapılmış, dolgulu kolon biyoraktörde 1-fenil etanol üretimi sürekli sistemde gerçekleştirilmiştir. Sürekli sistemde, asetofenon derişimi 15 mM, 25 mM ve 40 mM aralığında incelenmiştir. Substrat derişimi etkisi incelenirken, diğer parametreler, glukoz derişimi (0.02 g/mL), kalma süresi (4.5 h), sıcaklık (35 oC) sabit tutulmuştur. Saat başı örnekler alınarak 9 saat boyunca, R-1-feniletanol derişimi, dönüşüm ve enantiyomerik aşırılığın değişimi izlenmiştir. Girdi derişimi arttıkça, ürün derişimide artmıştır. 40 mM başlangıç girdi derişiminde, 12.8 mM R-1-feniletanol, 15 mM başlangıç girdi derişiminde ise 11.2 mM R-1-feniletanol (% 79 dönüşüm) elde edilmiştir. Kiral alkollerin endüstriyel üretiminde, yüksek ürün derişimi, yüksek verimlilik istenmektedir. 40 mM başlangıç girdi derişiminde, verimlilik 2.82 mmolL-1h-1, 15 mM başlangıç girdi derişiminde ise 2.50 mmolL-1h-1 verimliliğe ulaşılmıştır. Substrat derişiminin artmasının, dönüşümü olumsuz yönde etkilediği görülmektedir. Bunun nedeni, daha önceden serbest hücrelerle yapılan çalışmalar sonucu görülen substrat inhibisyonunun olmasıdır. Ancak çalışılan tüm asetofenon derişimlerinde, enantiyomerik aşırılık % 99 elde edilmiştir. Sürekli sistemde çalışırken yine, kofaktör rejenerasyonunda kullanılan glikoz miktarının etkisi incelenmiştir. Glikoz derişimi 0.01, 0.02 ve 0.03 g/mL aralığında incelenmiş, diğer parametreler, substrat derişimi (15 mM), kalma süresi (4.5 h) ve sıcaklık (35 oC) sabit tutulmuştur. Glikoz derişimi, 0.01 g/mL den 0.02 g/mL ye artırıldığında, dönüşüm % 46 dan % 79 e artmıştır. Glukoz derişiminin 0.03 g/mL ye çıkarılması ile dönüşüm % 34’e düşmüştür Burada, aşırı glukoz derişiminin inhibisyona neden olduğu görülmüştür. Sürekli sistemde, farklı akış hızlarında çalışılmış, buna bağlı olarak biyoreaktörede kalma süreleri sırasıyla, 2.25 saat, 3 saat, 4.5 saat ve 9 saat olarak bulunmuştur. Kalma süresi arttıkça yatışkın koşula gelme süresinin de arttığı gözlenmiştir. Düşük akış hızlarında 7 ila 8 saat arasında yatışkın koşula ulaşılmıştır. Yüksek akış hızlarında ise daha kısa sürede (4 h) yatışkın koşula ulaşılmıştır. Kalma süresinin 9 saat olduğu durumda % 86 dönüşüm ve % 99 enantiyomerik aşırılığa ulaşılmıştır. Kalma süresinin 4.5 saat olduğu durumda ise % 79 dönüşüm ve % 99 enantiyomerik aşırılığa ulaşılmıştır. Çalışılan en düşük kalma süresinde (2.25 saat) yani akış hızının çok yüksek olduğu durumlarda dönüşüm % 55’ e düşmüştür. Dönüşümdeki bu düşüş enzim-substrat etkileşim süresinin çok kısa olmasından yani dönüşüm için yeterli zaman olmamasından kaynaklanmaktadır. Enantiyomerik aşırılık kalma süresinden etkilenmemektedir. Çalışılan tüm kalma sürelerinde, % 99 enantiyomerik aşırılık elde edilmiştir. Kalma süresinin verimlilik ve R-1-Feniletanol derişimi üzerine etkisi incelenmiş, kalma süresi arttıkça, ürün derişimi artmış, ancak verimlilik azalmıştır. Yüksek verimlilik ve yüksek ürün derişimi elde edebilmek için 3.75 h kalma süresinin ekonomik olduğu bulunmuştur. Sürekli sistemler, kesikli sistemlere göre sürekli işletilmeleri nedeniyle tercih edilmektedirler. Çalışmada, dolgulu kolon reaktörün ne kadar süre işletilebileceği incelenmiştir. Tutuklanmış hücreler, 5 gün işletim süresince aktivetisinin % 90’ ını, 12 gün işletim süresince aktivetisinin % 50’ isini korumaktadır. Sonuç olarak, enantiyomerik saflıkta ( % 99) R-1fenil etanol üretimi, laboratuar ölçekte, tutuklanmış mikroorganizma ile sürekli sistemde başarı ile gerçekleştirilmiştir.